分子熒光分光光度計由光源發出的紫外光和藍紫光經單色器處理后特定波長的光照射到樣品池中，激發樣品中的熒光物質而發出熒光，熒光經過濾過和反射后，光信號被光電倍增管放大后，然后以圖或數字的形式在控制軟件上顯示出來。不同物質由于分子結構的不同，其激發態能級的分布具有各自不同的特征，各種物質都有其特征熒光激發和發射光譜，因此可以用熒光化合物的該特征來進行物質的定性鑒定。
分子熒光分光光度計的熒光測試注意事項：
①樣品應盛在四面透光的石英比色皿中，如果是揮發性樣品應使用帶塞的熒光池。
②在熒光分析時，為了得到穩定可靠的數據，一般需要開機預熱氙燈大約30min。如果儀器光源采用的是閃爍氙燈，預熱時間可以縮短到10min左右。對某些易感光、易分解的熒光物質，盡量采用長波長、低人射光強度及短時間光照。
③溫度變化可引起熒光強度的改變。通常降低溫度，有利于提高熒光量子產率，熒光強度增大。溫度影響熒光強度的顯著程度因樣品而異，大部分熒光物質的熒光強度受溫度影響不大，測試溫度變化不超過±3℃，對測試結果幾乎無影響。
④當熒光物質是弱酸或弱堿時，溶液的pH對熒光強度有較大影響。因為弱酸或弱堿在不同酸度中，分子和離子的電離平衡會發生改變，而熒光物質的熒光強度會因其離解狀態發生改變。
⑤分子結構中存在π-π共軛的熒光物質在極性溶劑中，熒光效率顯著增強。溶液中表面活性劑的加入能夠顯著提高熒光強度。
⑥瑞利散射和拉曼散射是溶劑的兩種散射光，應注意不要誤把瑞利散射和拉曼散射光譜當做熒光光譜。瑞利散射光波長與激發光波長相同，拉曼散射與激發光波長不同，而熒光物質的熒光波長與激發光波長無關，因此可以通過選擇適當的激發波長將拉曼散射光與熒光分開。在測試時選擇合適的狹縫寬度，或者空白扣除，也可以對散射光的影響進行校正。
⑦熒光物質分子與溶液中其它物質分子之間作用導致熒光強度降低，常見的熒光猝滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、硝基化物質、重氮化合物等。溶液中的溶解氧也能引起幾乎所有的熒光物質產生不同程度的熒光熄滅現象，因此，在較嚴格的熒光實驗中須除02。
⑧測試過程中注意不要肉眼盯著氙燈光源看，以防對眼睛造成損傷。
⑨儀器房應注意經常通風，避免產生的臭氧在室內富集。
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